Un cultivo estático líquido que utiliza una bolsa de película permeable a los gases contribuye a la microbiología

Bolsa de película TPX

La película TPX, de tipo bruto de 50 µm de espesor, se obtuvo de Fuji Chemi Trading Co., Ltd (nombre del producto Opulent, https://www.ftcj.co.jp/en_products/lp/release/). Se apilaron dos trozos de película y se sellaron térmicamente tres lados para crear una bolsa. El tamaño del espacio de cultivo se preparó sellando la bolsa con un clip de plástico o con tratamiento térmico (ver video complementario 1) para dar ca. 52 × 74 mm (para Escherichia coli y Bacilo sp.) o ca. 100 × 241 mm (para levadura). El volumen del medio fue de 2 ml para bolsas de 52 x 74 mm y de 12,5 ml para bolsas de 100 x 241 mm (0,052 ml cm^–2 de la huella de la bolsa). Las bolsas de película se esterilizaron en autoclave (121 °C, 1 atm, 20 min).

Presiones

Un no transformado Escherichia coli DH5α, cepa Rosetta (DE3) que porta el plásmido vacío pET28a( +) y Komagataella phaffii (X-33) se utilizaron como organismos modelo. Bacilo sp., putativo Bacillus amyloliquefacience¹⁵fue cultivado como un organismo formador de biopelículas.

Cultivo a partir del inóculo cultivado en suspensión de Escherichia coli DH5α

Las células se precultivaron durante 5 h (fase de crecimiento logarítmico) utilizando 5 ml de medio LB o TB en un tubo de polipropileno (3181–345, 27 mm de diámetro interior, Labcon) mediante cultivo con agitación líquida (37 °C, 180 rpm, diámetro de agitación, 2,5 centímetros). Se suspendieron dos mililitros de este precultivo en 300 ml de cada medio correspondiente y se transfirieron 2 ml de esta resuspensión celular a un tubo nuevo (3181–345) y una bolsa de película TPX. El tubo se agitó a 37 °C, 200 rpm, y la bolsa de película TPX se fijó estáticamente a 37 °C. La turbidez se midió cada 1 h midiendo la absorbancia a 600 nm (OD₆₀₀).

Cultivo de colonias de Escherichia coli DH5α

Para observar el crecimiento de colonias inoculadas directamente, las colonias se desarrollaron a partir de un stock congelado extendiéndolas en una placa LB que contenía agar al 1,5 % y cultivando a 37 °C durante 16 h. Se seleccionaron aleatoriamente tres colonias y se suspendieron en 300 ml de medio LB. La turbidez de esta suspensión se midió como turbidez inicial (“Inoc”). Se transfirieron dos mililitros de la suspensión nueva a un tubo nuevo, 3181–345, y a una bolsa de película TPX. El tubo se agitó a 200 rpm y la bolsa de película TPX se colocó a 37 °C durante 1 h.

Producción de plásmidos por Escherichia coli Roseta (DE3)

Escherichia coli Se cultivaron células Rosetta (DE3) que contenían el plásmido pET28a(+) a partir de colonias utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente, excepto que el medio LB contenía 50 µg·ml.^–1 kanamicina y cloranfenicol. Las células se recogieron del cultivo de 1 ml mediante centrifugación a 3000 gy 5 °C durante 30 min. El sedimento celular se suspendió en 200 µl de tampón (Tris-HCl 50 mM y EDTA 10 mM, pH 7,5) y las células se lisaron añadiendo 200 µl de solución de lisis (NaOH 0,2 M y SDS al 1%) seguido de mezclar 400 µl de neutralización. solución (acetato de potasio 1,25 M y ácido acético glacial 1,25 M). El sobrenadante se recogió por centrifugación a 18.000 g, 5 °C durante 10 min y se trató con RNasaA añadiendo 1 µl de 10 µg ml.^–1 solución madre de la solución e incubar a 65 ° C durante 30 min. Después de la extracción con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y la centrifugación a 18.000 g, 5 °C durante 10 minutos, el ADN se precipitó utilizando un volumen equivalente de 2-propanol con 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M mediante centrifugación. a 18.000 g, 5 °C durante 5 min, y luego se lavó con etanol al 70%. Después de la centrifugación a 18.000 g, 5 °C durante 5 minutos, el sedimento se secó al vacío y se disolvió en una cantidad adecuada de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) y EDTA･Na 1 mM.₂ buffer. La cantidad de ADN se midió utilizando un instrumento NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd).

Komagataella phaffii (X-33) cultura

La levadura se cultivó en medios tamponados con complejo de glicerol (BMGY) y medios tamponados con complejo de metanol (BMMY) siguiendo la guía del usuario del kit de expresión Pichia proporcionada por Invitrogen, Co. Ltd. La base de nitrógeno para levadura (YNB) se preparó con BD Difco YNB. sin aminoácidos (BD 291.940). Las colonias se inocularon en 30 ml de medio BMGY en matraces deflectores de 300 ml y se cultivaron a 200 rpm y 37 °C como precultivos. Después de 19 h, las células cultivadas se recogieron mediante centrifugación (1500 g, 25 °C durante 5 min) y se resuspendieron en medio BMMY para ajustar la DO.₆₀₀ a ~1,0 para producir una suspensión BMMY. Luego, se transfirieron 12,5 ml de esta suspensión de BMMY a un matraz deflector de 125 ml (1-8773-06, Thermo Fisher Scientific, Co. Ltd) y las células se agitaron a 200 rpm como control. El mismo volumen de suspensión BMMY se transfirió a FB. La temperatura de ambos cultivos se fijó en 30 °C. la sobredosis₆₀₀ se midió después de 24 h.

cultivo de Bacilo sp. y tinción con ácido periódico de Schiff (PAS)

El stock congelado de Bacilo sp. se suspendió en 100 mL de medio (30 g L^–1 peptona de soja, 10 g L^–1 glucosa, 1 g L^–1 kh₂correos₄0,5 g L^–1 MgSO₄·7H₂O, pH 6) y se colocaron 2 ml de la suspensión en la bolsa de película TPX. La bolsa se colocó estáticamente a 24 °C durante 48 h. Se cortaron todos los bordes de la bolsa y cada película dividida se lavó cuidadosamente con agua. Las sustancias adheridas quedaron completamente teñidas con la película. Las películas se colocaron en una solución de ácido periódico (1%) durante 10 minutos y se lavaron dos veces con agua. Luego se colocó la película en reactivo de Schiff (191-08441. Wako Co., Ltd) durante 10 min. La película se enjuagó tres veces con una solución de bisulfito de sodio-HCl (bisulfito de sodio 52 mM y HCl 45 mM) durante 3 minutos cada una y luego se lavó con agua del grifo.

Turbiedad

La turbidez de las suspensiones celulares se midió a 600 nm después de una dilución adecuada con medio nuevo (ver Información complementaria 2) usando un espectrofotómetro (UV1280, Shimadzu Co. Ltd).

Estadística

La importancia fue determinada por un t-prueba utilizando la función “T.TEST” en Microsoft Excel. La prueba se realizó como una muestra pareada de Student de dos colas. t-prueba con varianzas desiguales. Las desviaciones estándar se muestran en las figuras.