Un sistema de producción de medio de cultivo sin suero mediante cocultivo que combina células secretoras de factores de crecimiento y cianobacterias que asimilan l-lactato para la producción sostenible de carne cultivada

Los protocolos experimentales se ilustran esquemáticamente en la figura. 4.

Cultivo de algas

Metodología detallada para el desarrollo del recombinante yo-cianobacteria asimiladora de lactato Sinecococo El sp. KC0110 se puede encontrar en nuestra publicación anterior¹⁰Brevemente, la cepa KC0110 se estableció introduciendo el yo-permeasa de lactato (LLD P) y yo-gen de la enzima de conversión de lactato a piruvato (lldD) de Escherichia coli en la cianobacteria eurihalina unicelular Sinecococo sp. PCC 7002 (Instituto Pasteur, París, Francia). KC0110 se cultivó en medio A2 (310 mM NaCl, 20 mM Mg₂ENTONCES₄·7 horas₂O, 17,3 mM de NaNO₃8,3 mM Tris(hidroximetil)aminometano, 8,1 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂·2 horas₂O, 0,37 mM KH₂correos₄·3 horas₂O, 550 µM H₃BIENVENIDOS₃89 µM de Na₂EDTA·2H₂O, 31 µM de ácido cítrico, 30 µM de FeCl₃·6H₂O, 22 µM de MnCl₂·4 horas₂O, 12 µM CuSO₄·5 horas₂O, 2,3 µM de ZnCl₂0,21 µM de Na₂Mugir₄·2 horas₂O, 51 nM de CoCl₂·6H₂O, y 3 nM de vitamina B12) suplementada con 40 µg/mL de gentamicina (Fujifilm Wako Pure Chemical, Osaka, Japón) y 4 µg/mL de carbenicilina (Fujifilm Wako Pure Chemical) en una cámara para el crecimiento de plantas (Biotron LH-241PFDT-SC; Nippon Medical and Chemical Instruments, Osaka, Japón) bajo luz continua (temperatura: 25 °C; CO₂ Concentración: 1%; densidad de flujo de fotones fotosintéticos: 75,8 ± 8,3 µmol/m²/s (n = 5); velocidad de agitación: 60 rpm).

Cultivo de células de mamíferos

Mioblastos de ratón C2C12 (ATCC^® Las células epiteliales del hígado de rata CRL-1772™) y RL34 (JCRB0247) se cultivaron en DMEM que contenía 25 mM de glucosa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) suplementado con 10 % de FBS (Nichirei Biosciences, Tokio, Japón) y 1 % de penicilina-estreptomicina (P/S, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5 % de CO₂Con una confluencia del 85-95 %, las células C2C12 y RL34 se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Fujifilm Wako Pure Chemical), se subcultivaron mediante tratamiento con 0,025 % de tripsina/0,1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; Fujifilm Wako Pure Chemical) durante 5-10 minutos y se centrifugaron a 300×gramo durante 5 minutos a temperatura ambiente (20–25 °C). Las paletas de células se resuspendieron en medio de crecimiento, se filtraron utilizando un colador celular de 70 µm y se dividieron en la configuración experimental.

Monocultivo de células RL34

Las células RL34 se sembraron a una densidad de 0,25 × 10⁶1,0 × 10⁶y 4,0 × 10⁶ células/pocillo con DMEM que contenía 10% FBS y 1% P/S en placas de 6 pocillos (n.º de catálogo 353502, Corning, NY, EE. UU.) en condiciones estándar de cultivo celular durante 17 h para facilitar la fijación a la placa. Después de 17 h, las células se lavaron dos veces con PBS y el medio se reemplazó con DMEM sin FBS (2,5 mL). Posteriormente, las células RL34 se cultivaron en condiciones estándar de cultivo celular durante 4 días. El medio de monocultivo de células RL34 se recolectó diariamente durante el cultivo y se almacenó a -80 °C antes de su uso.

Cocultivo Transwell de células RL34 y KC0110

Las células RL34 y KC0110 se cocultivaron en insertos de cultivo celular colocados en placas de 6 pocillos (Corning). Las células RL34 suspendidas en DMEM con 10 % de FBS y 1 % de P/S se sembraron en placas de 6 pocillos a 4,0 × 10⁶ células/pocillo y se incubaron en condiciones de cultivo celular estándar durante 17 h para permitir la fijación a la placa. Después de la fijación de las células, las células RL34 se lavaron dos veces con PBS y el medio se reemplazó con DMEM sin FBS (1,5 ml). Al mismo tiempo, se colocaron insertos de cultivo celular (diámetro: 24 mm, tamaño de poro: 0,4 μm) (número de catálogo 353493, Corning) en las placas de 6 pocillos y se suspendió 1 ml de KC0110 en DMEM a densidades ópticas de 750 nm (OD₇₅₀) que representan concentraciones de algas de 1,0, 2,0 y 4,0, se sembraron en el inserto de cultivo celular. Las células KC0110 se centrifugaron a 15 000×gramo durante 5 min y se lavaron dos veces con DMEM antes de sembrarlas en el sistema de cocultivo transwell para excluir el Medio A2. El tamaño de poro del filtro de membrana dentro del inserto de cultivo celular fue de 0,4 μm, lo que impidió el transporte bacteriano a través de la membrana pero permitió el transporte de metabolitos. En el grupo de control, se añadió 1 ml de DMEM al inserto de cultivo celular. Las células se cocultivaron a 35 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO₂ bajo luz continua (12,6 ± 1,5 µmol/m²/s, n = 5) en el CO₂ Incubadora con luces LED durante 3 días.

Además, determinamos la cantidad de piruvato generado por las células KC0110 (OD₇₅₀ 2) cultivadas en medio de cultivo celular RL34, que se recolectó cuando las células RL34 alcanzaron la confluencia en una placa de cultivo celular de 100 mm (número de catálogo 664160-013, Greiner Bio-one, Kremsmuenter, Austria) en condiciones de cultivo celular estándar. Luego, las células KC0110 se lavaron con el medio de cultivo celular RL34, como se describió anteriormente. Se transfirió un volumen de 1,5 mL de medio de cultivo celular RL34 a una placa de 6 pocillos, luego se sembró 1 mL de células KC0110 suspendidas en el medio de cultivo celular RL34 en insertos de cultivo celular. Posteriormente, las células KC0110 se colocaron en una placa de CO₂ Incubadora (Astec, Fukuoka, Japón) con luces LED (luz LED sumergible SL-30, Tetra, Tokio, Japón) e incubada a 35 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO₂ bajo luz continua (12,6 ± 1,5 µmol/m²/s, n = 5) durante 3 días. El medio de cocultivo de células RL34 y KC0110 en transwell o el medio de monocultivo de células KC0110 se recogieron después de un período de cultivo de 3 días y se almacenaron a -80 °C antes de su uso.

Caracterización metabólica de medios acondicionados

Después del co-cultivo en mono o transwell, el medio de cultivo celular se centrifugó dos veces a 15.000×gramo durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar células y restos celulares. Los medios se sometieron a ensayos enzimáticos para cuantificar los niveles de glucosa, lactato, amonio, piruvato y LDH utilizando un analizador (Cedex Bio Analyzer, Roche Diagnostics, Tokio, Japón). Las mediciones se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para realizar una caracterización metabólica integral del sistema de cultivo celular. Además, los aminoácidos en los medios se analizaron utilizando un reactivo de análisis de aminoácidos (APDSTAG, FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Ltd, Osaka, Japón) y cromatografía líquida-espectrometría de masas (sistema automatizado de análisis de aminoácidos de Shimadzu, Kioto, Japón).

Evaluación de la proliferación celular

La actividad proliferativa del medio se evaluó evaluando la capacidad proliferativa de C2C12. Las células C2C12 suspendidas en DMEM con FBS se sembraron en placas de 12 pocillos (número de catálogo 353503, Corning) a una densidad de 6 × 10⁴ células/pocillo y se incubaron en condiciones de cultivo celular estándar durante 4 h para facilitar la adhesión celular. Después de la adhesión celular, las células se lavaron dos veces con PBS, el medio se reemplazó con medio de monocultivo RL34, cocultivo transwell de cepas RL34 y KC0110, o DMEM sin suero (1 ml por pocillo, respectivamente), y las células se cultivaron durante 2 días. El medio de monocultivo RL34 se aplicó directamente o se diluyó dos veces con DMEM, y el medio de cocultivo se transfirió directamente al cultivo de células C2C12. Se realizó recuento de células y microscopía óptica para evaluar la proliferación celular después de 2 días de cultivo.

Conteo de células

El número de células RL34 o C2C12 se determinó mediante un ensayo de exclusión con azul tripán antes de la siembra celular, después de la adhesión celular y después del cultivo celular. La densidad celular de la cepa KC0110 se determinó midiendo la DO₇₅₀ utilizando un SpectraMax M2^mi Módulo de cubeta (Molecular Devices, CA, EE. UU.) antes de la siembra de células y después del cultivo celular.

Tinción de inmunofluorescencia

Las células C2C12 cultivadas en diversos medios acondicionados se lavaron tres veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4 % (PFA, Muto Pure Chemicals, Tokio, Japón) durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la fijación, se eliminó el PFA y las células se lavaron con PBS y se trataron con Triton X-100 al 0,5 % (Sigma-Aldrich) en PBS durante 5 min a temperatura ambiente para permeabilizar las membranas celulares. Posteriormente, se descartó el Triton X-100 y las células se lavaron con PBS y se agitaron durante 30 min a 50 rpm con albúmina de suero bovino (BSA) al 2 % en PBS para bloquear la unión no específica. Posteriormente, las células se incubaron con un anticuerpo primario anti-MyoD de ratón (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, Texas, diluido 1:500 en solución de BSA al 2 %) en un agitador a 4 °C durante la noche. Posteriormente, el anticuerpo secundario (anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Alexa Fluor 488, Invitrogen, diluido 1:500 en solución de BSA al 2%) se dejó incubar con las células durante 1 h a temperatura ambiente con faloidina (faloidina Alexa Fluor 594, diluida 1:500 en solución de BSA al 2%) y tinción de Hoechst (Hoechst 33258, diluida 1:1000 en solución de BSA al 2%) al mismo tiempo. Finalmente, las imágenes fluorescentes se capturaron utilizando un microscopio de fluorescencia (ECLIPSE Ti2, Nikon, Tokio, Japón) equipado con el software requerido (NIS-Elements BR, Nikon).

Análisis estadístico

Cada experimento se realizó por duplicado o triplicado, y todos los datos se presentan como medias ± DE de al menos tres experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism versión 8.4.3 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE. UU.). La prueba de Mann-Whitney tú prueba y multiple aSe utilizaron pruebas para comparar los datos entre los dos grupos. Se realizaron comparaciones múltiples mediante análisis de varianza, seguido de la prueba de Tukey para cada media o la prueba de Dunnett para la media de control, según corresponda. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas en pag